无细胞蛋白质合成（cell-free protein synthesis, CFPS)也被称为体外蛋白质转录翻译，它是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来体外合成蛋白质。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞蛋白合成因其体系灵活开放、便于控制、表达周期短、高耐受性等优点，所以在药物研究、生物制造和生命科学等领域中得到广泛的关注与应用。

一、CFPS系统简介   

CFPS通过提取核糖体、氨酰-tRNA合成酶、翻译起始、延伸和终止因子、核糖体释放因子等转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的元素，并向其中添加DNA模板、能量（ATP）和各种辅因子(Mg2+和K+)，模仿胞内环境以合成目标蛋白质。    与传统活细胞表达系统相比，CFPS系统简化了基因克隆步骤，无需维持细胞的生长，反应体系简单，操作简便，生产周期短，能够提供一个开放通用的环境，可进行实时的活性监测，可快速取样，可直接控制蛋白质合成过程。比如，可产生难表达蛋白质（膜蛋白）和细胞毒性蛋白；反应迅速可以高通量筛选蛋白；蛋白合成过程没有代谢副产物；可实现非天然蛋白质的合成等等。

二、CFPS系统类型    

CFPS系统利用了微生物、植物或动物细胞提取物中的能量和蛋白质合成所必需的成分来生产目的蛋白质。虽然任何生物体都可以提供裂解物，但最常见的CFPS系统主要分为两种类型：一类是直接来源于细胞裂解物，最常见的细胞提取物来源是大肠杆菌、小麦胚芽、酵母细胞、兔网织红细胞、CHO细胞和昆虫细胞等；另一类是纯化后的体系，即从大肠杆菌中纯化的一系列转录和翻译元件重新组合而成的无细胞转录翻译系统，称为PURE 体系。使用PURE系统，所有元素都是已知的，可控的，无核酸酶和蛋白酶，并且可以优化每种元素的浓度以实现蛋白质最大化的表达，但成本高，因此目前一般还是采用以粗提物为基础的CFPS系统。   这些天然细胞本身的特性不同，从它们中得到的提取物必然也是不同的，它们存在各自的优缺点。因此可根据目的蛋白质类型选择合适的提取物。

三、CFPS系统在生物医药的应用   

由于成本、工业放大和蛋白质折叠不再是CFPS系统不可逾越的障碍，因此可以利用无细胞蛋白质合成进行商业化生物医药蛋白的生产。国内的康码生物已建成吨级的体外合成蛋白质生产基地，可见CFPS系统在生物制药领域，具有十分重要的意义。

1、蛋白类药物

疫苗：传统的疫苗存在生产时间长、病毒原料风险大、免疫原性弱、稳定性差等因素的限制，还有一些疫苗在生物体内生产易产生错误的糖基化免疫原性蛋白，这可能诱发不正确的免疫应答，这些因素最终制约了疫苗的安全、快速生产和广泛应用。而CFPS系统可快速生产蛋白质，不受细胞活力的约束，具有高度可优化的开放系统，可用于按需生物制造，是具有前景的疫苗生产工具。例如，Vaxcyte公司通过现代无细胞蛋白质合成平台重新设计高度复杂的疫苗制造方式，Vaxcyte目前正在开发多款细菌疫苗产品，其中24和31价肺炎球菌结合疫苗即将进入3期临床，在研的新型疫苗还有VAX-PG，VAX-GI和VAX-A1等。

抗体：目前抗体药物主要包括单抗，双抗，ADC和多特异性抗体治疗药物，现阶段生产抗体主要是基因重组的方式大规模生产的，即主要通过哺乳动物细胞系进行生产，但是体内表达的生长周期限制了下一步筛选的速率，下游的纯化过程也有一定的难度，并且一些复杂抗体很难合成。因此，抗体的合成需要一个更快捷的生产体系，而CFPS凭借其反应迅速、纯化简单并且真核无细胞体系能够满足复杂抗体的后修饰需求，所以将成为合成抗体的新兴体系。例如，Sutro Biopharma公司专注于利用无细胞蛋白合成平台开发ADC和多特异性抗体疗法,其中STRO-001产品，针对CD74的ADC，其适应症为多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤；以及STRO-002，针对叶酸受体-α的ADC，用于治疗卵巢和子宫内膜癌。目前这两款药物都处在1期临床。（值得提醒：Vaxcyte公司分拆自美国生物制药公司Sutro Biopharma，无细胞蛋白合成平台由Sutro Biopharma独家授权）

2、翻译后修饰药物

翻译后修饰 (Post-translational modification，PTM) 指蛋白质在翻译后的化学修饰，可以极大影响蛋白质的折叠、活性和稳定性等方面，在生物体中发挥着重要作用，很多医药蛋白都具有不同形式的后修饰，这在异源宿主中通常是很难表达的。相比之下，CFPS系统允许其组分灵活加减，为蛋白质折叠和精准化修饰提供了可控环境。目前已发现几百多种不同的官能团修饰类型，常见的PTM形式有糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等，本文着重介绍糖基化和磷酸化这两大主要的翻译后修饰类型。   

蛋白质糖基化修饰是主要的PTM类型之一，发生在50%真核蛋白质上，大多数FDA批准的生物医药上都有糖基化修饰，对重组蛋白质药物的生产尤为重要，因为糖基化不当，会对药物的活性、稳定性、免疫原性和半衰期产生不利。目前由于细胞代谢的复杂性和干扰，在细胞中构建和测试来确定蛋白质糖基化修饰仍然具有挑战性。例如，Yadavalli R等研究一种糖基化疟疾蛋白，之前使用原核和真核细胞表达的疟疾蛋白糖基化不佳，可溶性差，折叠不当，导致免疫原性降低。而尝试基于HeLa细胞的CFPS却可以体外合成了糖基化的疟疾蛋白。   

蛋白质磷酸化修饰是第二大类蛋白质后修饰，磷酸化是磷酸基团与蛋白质的可逆结合，然而由于技术限制，无法以高纯度和高产量生产具有特定磷酸化状态的磷酸化蛋白，Oza等通过原核CFPS体外合成了高活性的双磷酸化人MEK1激酶，首次证明了使用CFPS平台可以显著提高磷酸化蛋白合成的产量和产率。

3、非天然蛋白药物   

非天然氨基酸 (Unnatural amino acids, UNAAs)嵌入是利用含有特殊侧链的非天然氨基酸取代天然氨基酸，用来改善多种具有新的理化性质和生物学功能的蛋白质。由于天然氨基酸侧链功能基团的有限性，单靠20种标准氨基酸已不能满足科研日益增长的需求 ，迄今已有超过150种非天然氨基酸可以引入生物体内，其中大多数非天然氨基酸是天然氨基酸的衍生物，因此作为一个强大的合成生物学工具，在非天然生物蛋白药物领域引起了极大的关注。   

非天然氨基酸嵌入主要有两种方法：一种是全局抑制，利用天然翻译机器将非天然氨基酸嵌入蛋白质; 另一种是最常用的琥珀抑制，利用琥珀终止密码子，依赖于正交翻译系统的突变氨酰tRNA合成酶和tRNA配对，将非天然氨基酸嵌入蛋白质。但是这些方法都需要维持细胞的生长状态，其过程繁琐导致产量低，且一些UNAA不易穿过细胞膜，还会对细胞产生毒性，抑制细胞生长，这些都限制了UNAA的嵌入效率。而CFPS没有细胞膜的屏障，能够提高UNAA的利用率和保真度，目前CFPS系统已成功应用于这两种方法，并且非常容易地通过优化非天然氨基酸的浓度以避免非天然氨基酸嵌入的低效率瓶颈，因此生物医药领域越来越多的使用CFPS体系进行非天然蛋白质的合成。例如，Sutro Biopharma公司在ADC药物的开发中，利用CFPS平台为抗体和抗癌药物之间的稳定连接提供了更有效的UNAA嵌入和偶联方法。   

除此之外，CFPS系统已在基因电路设计、膜蛋白、病毒样颗粒、多肽、蛋白质进化，还有“人工生命”构建包括噬菌体合成和人工细胞构造等研究中展现出巨大的应用潜力。

一、挑战与展望   

尽管CFPS比活细胞系统具有诸多优势，然而无细胞蛋白质合成系统的发展中，仍然面临诸多挑战。其中最大障碍是工业规模化和成本，一些难合成的蛋白质生产离不开动物和昆虫细胞的提取物，然而制备过程繁琐，耗时较长，是扩大工业化生产有待解决的一大问题；此外还有昂贵试剂成本的限制。   

在未来的发展中，无细胞体系需要进一步优化以提高效率、降低成本、提高系统的稳定性，实现更好的蛋白质翻译后修饰，同时提高蛋白合成的个性化、多样化和普适性。此外随着AI技术的快速发展，AI可以赋能无细胞蛋白合成，其AI可以利用算法分析数据，预测蛋白质表达的最佳参数，实现高通量表达并改善合成效率。例如，Tierra Biosciences公司通过将自动化技术和AI学习平台实现了无细胞蛋白质合成的高效快速生产，这种技术的突破不仅大幅提高了生产效率，还降低了成本，使得大规模生产成为可能。尽管CFPS还面临很多挑战，但是人们通过不断的探索和研究，有望继续创新和发展，相信不远的将来，CFPS系统将会成为蛋白质合成的通用平台，即将迎来生物医药新时代。

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北京鸿润宝顺科技有限公司创建于2008年，位于北京自由贸易试验区科技创新片区，是一家以蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、等微生物培养基原材料和发酵原料为主，集研发、生产、销售为一体的现代化高新技术企业。2020年在四川省阆中市建立生产基地。产品供应国内外所有生物医药产区，为行业企业提供大量生物发酵所需的有机氮源原料，不断创新技术、调整配方、升级工艺，用更好的产品助力行业发展。

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