肌酸（Creatine，CR）是健身爱好者耳熟能详的补剂，它不但能提高肌肉的能量储备，帮助短时间高强度运动恢复，甚至在认知功能和神经保护方面也展现出潜力，随着应用范围不断扩大，全球对肌酸的需求正持续增长。

然而目前，合成肌酸的传统的化学合成法存在诸多问题。工业上常用氰胺和肌氨酸作为原料，这不仅依赖高能耗的化工流程，还会产生氰化物、二氰二胺和二氢三嗪等有毒副产物，带来环境与健康风险。因此，寻找绿色、经济、安全的生产方式成为科研界的重要目标。

近日，江南大学生物工程学院徐美娟团队在 ACS Sustainable Chemistry & Engineering 发表了一篇题为“Economical Production of Creatine in Corynebacterium glutamicum via a Multisubstrate Self-Cycling System”的研究成果。他们通过代谢工程手段改造谷氨酸棒状杆菌，成功构建出一条高效、低成本的肌酸生物合成通路，不仅消除了对昂贵底物的依赖，还实现了生产成本的 92.2% 下降。

谷氨酸棒状杆菌是一种典型的工业微生物，早已广泛应用于氨基酸（如谷氨酸、赖氨酸）的大规模生产，它的安全性高，被美国 FDA 认定为 GRAS（普遍认为安全）。更重要的是，研究团队此前已经改造出一株高产 L-精氨酸的工程菌株，可为后续肌酸合成提供稳定而丰富的前体。

在人体内，从精氨酸到肌酸的生成主要分为两步反应：

AGAT（精氨酸-甘氨酸转胺酶）：将精氨酸的胍基转移给甘氨酸，生成胍基乙酸（GAA）；GAMT（胍基乙酸甲基转移酶）：利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，将 GAA 转化为肌酸。

研究团队首先将来源于蓝藻的 AGAT 和人源 GAMT 基因导入谷氨酸棒状杆菌，从而构建了一个完整的合成途径。

图 | 在谷氨酸棒状杆菌中构建的肌酸合成路径

然而若要实现肌酸在微生物体系中的高效合成，仍需要克服多个代谢瓶颈。

前体 GAA 合成受限。在初始工程菌株中，尽管细胞可积累足量的L-精氨酸，但 AGAT 的催化效率较低，导致 GAA 生成不足。为此，研究人员通过核糖体结合位点（RBS）工程调控 AGAT 的翻译水平，显著提升了其可溶性表达和催化能力，结果显示，GAA 的积累与肌酸产量呈正相关，优化后的菌株肌酸水平显著提高。

图 | 通过调节 AGAT 基因的表达强度，提高 GAA 合成效率并促进肌酸生成

鸟氨酸反馈抑制。研究人员发现，在 GAA 生成过程中产生的副产物 L-鸟氨酸会对 AGAT 产生反馈抑制，从而限制代谢通量，因此研究团队通过重构鸟氨酸循环，提高了其向L-精氨酸的转化效率，同时增强了碳酰磷酸合成途径以保证反应底物供应。

经过改造后，鸟氨酸积累得到消除，从而有效接解除了其对 AGAT 的反馈抑制效应，前体利用效率进一步提高。

SAM 供应不足。GAMT 催化反应一般依赖于 SAM 作为甲基供体，然而，细胞内 SAM 水平常常有限，若外源添加则成本高昂，为此，研究团队设计了一个 SAM 自供给系统。

首先，研究人员通过引入来自大肠杆菌的高效甲硫氨酸腺苷转移酶（MetK），显著提高了 SAM 的合成效率。其次，为避免副产物 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）在细胞内的积累并对甲基转移反应造成抑制，研究人员导入了来源于酵母的 SAH 水解酶，加速其分解并实现循环利用。最后，考虑到 SAM 合成对能量需求较高，研究团队构建了 ATP 再生模块，通过腺苷激酶与多聚磷酸激酶协同作用，将腺苷高效转化为 ATP，为 SAM 持续合成提供充足能量。

图 | 通过建立 SAM 自供给与 ATP 再生系统，大幅提升了 SAM 水平，降低外源添加成本

改造后，细胞内 SAM 的水平大幅提高，既避免了对外源添加的依赖，也大大降低了生产成本。

在完成上述多轮优化后，研究团队进一步在基因组中多拷贝整合 gamt 基因，提高了 GAA 向肌酸的转化效率。

最终，优化后的工程菌株表现出了优异的生产性能。

优化株系在 5 L 生物反应器中实现了 16.8 g/L 的肌酸产量，生产速率为 0.23 g/(L·h)，产率为 0.10 g/g 葡萄糖，均为目前报道的最高水平，更重要的是，整个过程无需外加昂贵的底物 GAA 或 SAM，真正实现了低成本、可持续的生物制造。

图 | 放大到 5 L 生物反应器后，肌酸产量达到 16.8 g/L，创下新纪录

总之，该研究系统性解决了肌酸合成中的前体不足、反馈抑制和 SAM 供体短缺等关键问题，建立了一个多底物自循环的高效合成体系。与传统化学合成相比，该方法不仅消除了有毒副产物风险，还实现了超过 90% 的成本下降，具有显著的产业化潜力。

未来，相信该策略还可拓展应用于其他高附加值营养素和药物的绿色生产，展示了合成生物学在可持续生物制造中的广阔前景。
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